A vér-agy gát és sejttenyészetes modellezése

Mai vér-agy gát fogalmunk kialakulását hosszas kutatómunka előzte meg. Létezésének gondolata először a XIX. század vége felé vetődött fel. Paul Ehrlich német kutató 1885-ben figyelte meg, hogy ha állatok vérkeringésébe savanyú anilinfestéket juttat, az intenzíven festi a szervezet szöveteit, kivéve a központi idegrendszert. Ehrlich ezt azzal magyarázta, hogy az idegszövet affinitása a festékhez jóval kisebb, mint a test többi szövetéé. Ehrlich tanítványa, Edwin E. Goldmann 30 évvel később fedte fel a jelenség pontos hátterét: kísérletében a cerebrospinális folyadékba juttatott tripánkék festék azonnal megfestette a központi idegrendszert, viszont a többi szerv megfestetlen maradt. Ezen megfigyelés alapján egy bizonyos barrier jelenlétére következtetett, ami miatt a festék nem tudott átjutni Ehrlich kísérleteiben a vérből az idegrendszerbe, illetve fordítva, a saját kísérleteiben az idegrendszerből a véráramba, és a többi szövetbe.

Mai ismereteink a vér-agy gátról már sokkal kiterjedtebbek, részletesebbek, melynek  kialakulásához számos kutató munkája hozzájárult és hozzájárul.

 

A gerincesek többségében, így az emlősökben és az emberben is a vér-agy gát morfológiai alapját az agyi mikroerek egy rétegben elhelyezkedő endotélsejtjei alkotják. A vér-agy gát különleges tulajdonságainak kialakításában és fenntartásában alapvető szerepet játszanak az endotélsejteket körülvevő asztroglia, mikroglia, pericita és idegsejtek (1. ábra).

 

 

Az agyi endotélsejtek a perifériás endotélsejtekhez hasonlóan szabályozzák többek között a véralvadást, az értónust és az agyi keringést vazoaktív anyagok (nitrogén monoxid (NO), adrenomedullin, endotelin-1, angiotenzinek, prosztaglandinok, leukotriének, stb.) termelésével, és a lipoprotein metabolizmust és transzportot scavenger receptoraik segítségével. 

Azonban a vér-agy gát endotélsejtjei számos tulajdonságukban különböznek a perifériás endotélsejtektől. Közöttük szoros kapcsolatok (latinul zonula occludens, angolul tight junction, TJ) találhatóak, amelyek összekapcsolják az agyi endotélsejteket és mechanikai akadályt alakítanak ki, így a sejtek között, az ún. paracelluláris úton nincs szabad anyagáramlás vízoldékony molekulák számára (2. ábra; 3. ábra 2. transzportút). A junkciók fontos elemei az integráns membránfehérjék, amelyek létrehozzák a sejtek közötti szoros kapcsolódást, míg a citoplazmás részükkel az aktin citoszkeletonhoz kötődnek perifériás  membránfehérjéken keresztül, mint például a zonula occludens fehérjék (ZO-1, -2, -3) és a cingulin. Az integráns TJ membránfehérjék közé soroljuk az occludint, a claudinokat és a junkcionális adhéziós molekulákat (JAM). A TJ-höz szignál molekulák kötődnek, amelyek jelátvivő útvonalakban vesznek részt, így a kapcsolatok szorosságát is befolyásolják (2. ábra). Az agyi endotélsejtek további jellegzetessége, hogy kevés bennük a sejten belüli pinocitotikus vezikula, ezért a sejteken keresztüli transzport is korlátozott. Ezt tükrözi az agyi mikroereken in vivo mért igen magas, mintegy 2000 Ω transzendoteliális elektromos ellenállás. Ezen kívül nagyszámú mitokondriumot is tartalmaznak, a folyamatok energiaigényének fedezésére.

 

Az endotélsejtekkel közös bazális membránon osztoznak a periciták (1. ábra). A periciták többféleképpen járulnak hozzá a vér-agy gát tulajdonságainak kialakításához: sejten belüli aktin hálózatuknak köszönhetően kontrakciójuk és relaxációjuk révén szabályozzák a mikrovaszkuláris véráramlást hasonlóan a nagy erek simaizomzatához, továbbá az endotélsejteken keresztül szabályozzák a véredények növekedését és vaszkuláris stabilitását. Az agyi kapillárisok külső felületét nagy részben beburkolja az asztrociták hosszú, vékony nyúlványainak, az úgynevezett végtalpaknak a szövedéke. Ez a végtalp-burkolat lehetővé teszi az endotél- és gliasejtek közötti kommunikációt, kölcsönhatást és az endotélsejteken keresztüli anyagtranszportot. A glia- és endotélsejtek közötti kétirányú kommunikáció többféleképpen is megvalósul: a sejtek által termelt szolubilis faktorok és mediátorok által, mint az angiopoietin-1, fibroblaszt növekedési faktor-2 (FGF-2), transzformáló növekedési faktor-β (TGF-β), továbbá közvetlen membrán kontaktus révén és kétirányú, gyors Ca 2+ -szignál átadással.

 

Az agyi endotélsejtek szerkezeti felépítéséhez speciális funkciók társulnak, melyek sok tekintetben hasonlítanak és meg is egyeznek a polarizált epitéliumban található sajátosságokkal. A sejtek luminális (vér felőli) és abluminális (agy felőli) oldalán eltérő az ioncsatornák, transzporterek és receptorok kifejeződése, ezt nevezzük polaritásnak, amit szintén a sejtek közötti kapcsolatok hoznak létre. Az anyagszállítás különböző módon zajlik az endotélsejt rétegen keresztül. Az idegrendszer sejtjeinek működéséhez szükséges tápanyagok (glükóz, aminosavak, purinok, kolin, vas, lipidek, vitaminok, stb.) átjuttatását speciális transzportrendszerek végzik (3. ábra, 6. transzportút).

 

 

A szállítófehérjék fontosságát mi sem jelzi jobban, mint hogy az agyi hajszálerek, illetve az agyi endotélsejtek genomjának 11 %-át teszik ki. Az idegrendszeri működéshez szükségtelen, illetve káros anyagok kívül tartása, eltávolítása valamint az agyi metabolitok szintjének szabályozása efflux pumpák segítségével történik (3. ábra, 5. transzportút). Ezek az egyirányú, agyból a vér felé pumpáló fehérjék akadályozzák meg a mérgező növényi vagy mikrobiális alkaloidák és egyéb xenobiotikumok bejutását az idegrendszerbe. A vér-agy gáton előforduló ilyen efflux transzporter a P-glikoprotein (Pgp), vagy a multidrog rezisztencia fehérjék (MRP1,4,5 és 6). A Pgp transzmembrán glikoprotein az agyi endotélsejtek luminális membránjában található és a vér-agy gáton leírt első efflux pumpa. A transzporter működése során ATP-függő módon képes a xenobiotikumok mellett igen nagyszámú gyógyszernek a vérkeringésből a központi idegrendszerbe való bejutását megakadályozni. Ilyen gyógyszerek például a citosztatikumok közé tartozó Vinca alkaloidok, az antibiotikumok, egyes antiepileptikumok, a digoxin és az AIDS kezelésére használt humán immundeficiencia vírus proteáz inhibitorok. Emellett a Pgp aktivitását számos, a gyakorlatban kiterjedten használt gyógyszer, mint a verapamil, a ciklosporin A, vagy a vincristin jelentős mértékben gátolja, ami befolyásolja más hatóanyagok agyi permeabilitását is, ezért terápiás kezeléseknél figyelembe kell venni. Az MRP-1 fehérje ligandjai a leukotriének és a glutation-konjugált vegyületek, de számos gyógyszer agyba való bejutását is megakadályozza. 

Az influx és efflux transzport rendszerek mellett a folyamatokban az úgynevezett metabolikus vér-agy gát is szerepet játszik, amely specifikus enzimekkel (monoamino oxidázok, endopeptidázok, γ-glutamil-transzpeptidáz, aromás aminosav dekarboxiláz) további védelmi vonalat alkot a központi idegrendszer számára.

 

A vér-agy gát kutatásban mérföldkövet jelentett, amikor először sikerült agyból mikroér-frakciót izolálni Joó Ferencnek és munkatársainak Szegeden. Ezzel létrehozták a vér-agy gát első in vitro modelljét, amely lehetővé tette élő és metabolikusan aktív agyi endotélsejteken receptorok, transzport folyamatok és másodlagos hírvivő rendszerek azonosítását és vizsgálatát. Az izolált agyi mikroerekből tenyésztési körülmények között endotélsejtek nőttek ki. Az agyi endotélsejt tenyészetek alkalmazása nagy előrelépést jelentett a vér-agy gát funkciók részletesebb megismerésében. Vizsgálhatóvá váltak molekuláris és farmakológiai kölcsönhatások, amelyek az agyi endotélsejtek permeabilitási viszonyait, és ennek következtében gyógyszerek bejutását befolyásolják a központi idegrendszerbe. Az 1980-as évek elejétől számos állatfajból (szarvasmarha, sertés, egér, patkány, majom, kutya, macska), sőt emberi agymintákból is sikeresen állítottak elő agyi endotélsejt tenyészeteket. Azonban hosszantartó tenyésztés, illetve többszöri passzálás esetén a sejtek elveszítik különleges, a vér-agy gátra jellemző tulajdonságaikat, mint speciális enzimek, transzporterek, TJ struktúrák. A dedifferenciálódás megakadályozható, ha az endotélsejteket asztroglia sejtekkel ko-kultúrában tenyésztjük együtt, mivel az asztroglia sejtek serkentik az endotélsejtek specifikus enzimeinek és transzportereinek expresszióját és aktivitását. A ko-kultúrát különböző pórusméretű áttetsző membránból készült steril tenyésztő betétek teszik lehetővé (4. ábra).

 

Vér-agy gát modellkísérletek során primer tenyészeteket használunk általában, melyek előnye az állatkísérletekkel szemben, hogy számos anyag átjutását direkt mérésekkel követhetjük. Hátrányuk viszont, hogy költségesek és időigényesek, és nehéz biztosítani a tenyészetek tisztaságát és homogenitását. A primer tenyészetekben periciták, simaizomsejtek és fibroblasztok is előfordulhatnak, amelyek rontják az endotélsejtek szoros egymáshoz kapcsolódását. Egy új módszerrel szelektálni lehet az agyi endotélsejteket a tenyésztés első két napjában. Ha puromicinnel, egy Pgp-ligand toxikus antibiotikummal kezeljük a tenyésztés első két napján sejtjeinket, a nagy számban Pgp efflux pumpát expresszáló agyi endotélsejtek sikeresen távol tartják a puromicint a sejt belsejétől, míg a többi sejt a kezelés hatására elpusztul. Az így nyert, több mint 98 %-ban agyi endotélsejtet tartalmazó kultúra alkalmas kísérletezésre: különböző hatóanyagok vér-agy gát permeabilitásra való hatásának tesztelésére, toxicitási vizsgálatokra, transzportfolyamatok tesztelésére. Tehát hatékonyan kiaknázható a módszer a gyógyszerfejlesztés különböző fázisaiban és a pre-klinikai vizsgálatok során.