A klónozásról

A 20. század végén nagy áttörést jelentett az a bejelentés, mely szerint sikeresen klónoztak
testi sejtből egy emlős állatot. 1997-ben megszületett az első klónozott bárány: Dolly.

A bejelentés nagy jelentőséggel bírt. Ezzel bizonyítottá vált, hogy egy differenciálódott testi
sejt DNS-e alkalmas egy új, soksejtű szervezet létrehozására.

Az Eötvös Loránd Kollégium Biológia Műhely egyik érdekfeszítő témája a klónozásról szólt.
Dr. Dinnyés András Professzor tartott előadást a klónozás múltjáról, jelenéről és jövőjéről,
és az őssejtkutatásról.

A professzor a Sir Ian Wilmut által vezetett edinburghi Roslin intézet NT (nuclear transfer) laborjában dolgozik, ahol Dollyt klónozták.

Jelenleg Gödöllőn, a Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpontban végzi munkáját, ahol 2006-
ban egeret, 2007-ben pedig nyulat klónoztak sikeresen.
 

„A klónozás: az anya vagy donor szervezet genetikai állományának átörökítése az utódszervezetbe ivaros folyamat nélkül.”

A klónok genetikai állománya megegyezik az anyaszervezet genetikai állományával.

A klónozás esetében talán nem teljesen pontos a fentebb írt definíció, hiszen nemcsak
szervezet szintjén, hanem alacsonyabb szerveződési szinteken is megvalósulhat a klónozás.
Molekulák szintjén, például a DNS molekula klónozása megvalósulhat természetes úton is a
sejtosztódásoknál, valamint mesterséges úton a PCR technológia segítségével.

Sejtszintű klónozásnál baktériumokat, élesztő sejteket klónozunk laboratóriumban. De a naponta osztódó sejtek is egymás klónjainak tekinthetők, hiszen genetikai állományuk megegyezik a kiindulási sejt genetikai állományával.

A szervezet szintű klónozásnak két főbb típusa ismeretes

Az egyik az embrióosztás. Ezt háziállatoknál alkalmazzák. 8 sejtes állapotban szétválasztják a sejteket, 4db egyenként 2 sejtes részre, így az utódok egymás klónjainak tekinthetők. Fontos megemlíteni, hogy itt a petesejt megtermékenyül, tehát nem igazi klónozásról van szó. A hatékonysága a módszernek igen kicsi: 100 db nyolcsejtes zigótából csak 300 embrió fejlődik, és csak egy születik meg.

A másik módszer a szomatikus sejtmag átvitel. (somatic cell nuclear transfer/SNT)
Dolly klónozása az utóbbi módszerrel valósult meg. Az SNT-vel való klónozásnak sok buktatója van. A mai napig nem ismerjük teljesen azokat a szabályozási mechanizmusokat, amelyek a sejtek differenciálódásában részt vesznek. A sejtek
differenciálódását vizsgáló kutatások már jóval korábban is folytak.

1930-ban a híres Spemann-Mangold kísérletben az egyes sejtek induktív tulajdonságait tanulmányozták. Ez volt az első olyan meghatározó kísérlet, amelynek során sikerült felfedni néhány fontosabb differenciálódási mechanizmust. Az első „igazi” klónozási kísérletek talán az 1950-es években kezdődtek el. A kísérletekben békákat használtak. Rana pipiens, és Xenopus laevis fajoknál az embrionális sejtek sejtmagjait transzplantálták egy magjától megfosztott petébe. A klónozás ebben az esetben sikeres volt, hiszen az embrionális sejt visszanyerte totipotens állapotát, és normális adulttá fejlődött az embrió. Ezt a módszert kipróbálták más, az adult állatból származó szomatikus sejtekkel is. A kísérletek kevésbé voltak eredményesek, mert ezek az embriók csak az ebihal állapotáig jutottak el. Mégis nagy jelentőséggel bírtak, mert rávilágítottak egy fontos a tényre: a testi sejtek megtartották azokat a genetikai információkat, amelyek ahhoz szükségesek, hogy az ebihalban kialakítsák a különböző sejttípusokat.

További kutatások indultak el, melyben emlősöket és kétéltűeket is vizsgáltak. Megállapították, hogy minél jobban differenciálódik egy sejt, annál nehezebb
„újraprogramozni” a sejt genetikai állományát, ezzel drasztikusan csökken a sikeres klónozás lehetősége.

Az 1980-as években emlős állatokból származó embrionális sejteket használtak klónozáshoz. Az akkori modern mikromanipulációs rendszerek segítségével sikerült több klónozott állatot előállítani. Ekkor megnövekedett az érdeklődés a tenyésztett haszonállatok klónozása iránt. Itt a cél elsősorban a transzgenikus állatok előállítása volt.

A kezdeti sikertelenségek a testi sejtek klónozásánál elkedvetlenítette a kutatókat. Úgy gondolták, hogy a testi sejtek genetikai anyaga nem alkalmas egy új többsejtű élőlény kialakítására. Ez a tévhit azonban 1997-ben Dolly születésével megdőlt.

A módszer, amivel sikerült Dolly-t klónozni a következő volt:

A bárány testi sejtjének (jelen esetben emlőhámsejtnek) sejtmagját, egy magjától megfosztott érett petesejttel fuzionáltatják elektromos áram segítségével.

Miután elkezd osztódni, és elérte a hólyagcsíra állapotot, beültetik egy anyaállatba, aki később megszüli a klónt.

A módszernek nagyon sok nehézsége van. Ahhoz, hogy szomatikus sejtekből klónozzunk, meg kell szüntetni azokat a genetikai módosításokat, amelyek megakadályozzák, hogy egy adott szomatikus sejt más irányba differenciálódjon. A sejt genetikai anyagát újra kell programozni, ahhoz, hogy ismét totipotens legyen.

A mai napig hiányosak az ismereteink az epigenetikai módosítások mechanizmusáról. Egyes gének aktiválását nagymértékben befolyásolják a DNS metiláltsága, valamint a hiszton acetiláció is.

Metiláció:

A DNS-ben található citozinban és guaninban gazdag régiókat CpG szigeteknek nevezzük. A DNS metiláció nagyon gyakran CpG dinukleotid szekvenciákon következik be. A metilációt DNS metiltranszferáz végzi. A módosítást különböző CpG kötő domént tartalmazó fehérjék ismerik fel. A metilációnak szerepe van a genom stabilitásában, a transzpozonok elleni védekezésben, valamint központi szerepet játszik a differenciáció alatti transzkripciós represszióban is.

A szarvasmarháknál és más fajoknál is megfigyelték, hogy a szomatikus sejtekből klónozott embriók metilációs szintje szignifikánsan eltér a kontroll embriókhoz képest. Ezekben a kutatásokban a repetitív szekvenciák metiláltságát és a globális metiláltságot vizsgálták. A természetes úton létrejött embrióknál a repetitív szakaszok hipermetilálva voltak. A mai napig nem tudjuk, hogy a klónozott állatokban az ugyancsak hipermetilált repetitív szakaszok miért okoznak fejlődési rendellenességeket. Az abortált klónozott magzatokban a metilátsági szint alacsony volt. A DNS metiláltságának drasztikus csökkenése, tehát szorosan összefügghet a
klónozott magzat túlélési esélyével.

A metiláció mellett fontos megemlíteni az acetilációt is, hisz ez egy olyan epigenetikai
módosítás, ami befolyásolja a gének aktivitását. Az acetilációt a hiszton acetiltranszferáz enzim végzi. A H3, H4, H2B hisztonok lizinjei acetilálódhatnak. A kétéltűekben a deacetiláció megállította az embrionális fejlődést, az egerekben a hyperacetiláció fokozta a zigotikus genom aktivitásást.

A donor sejtek sejtmagjai származhatnak az embrióból, valamint a kifejlett állat szomatikus sejtjeiből is.

Az embrionális klónozás során nem mindegy, hogy milyen típusú sejteket alkalmazunk. A különböző embrionális sejttípusoknak eltér a klónozási hatékonysága. Az alábbiakban összefoglalom ezeket a sejttípusokat és tulajdonságaikat.

Embrionális sejttipusok:
Blasztomerek:

A megtermékenyülés után a zigóta osztódni kezd és egyre kisebb sejtek keletkeznek. Ezeket blasztomereknek nevezzük. A blasztomereket talán a legkönnyebb klónozni, mivel ezek még totipotensek egészen a 8 sejtes állapotig. Az első sikeres klónozásoknál is a blasztomereket használtak fel. A klónozási hatékonyság nagymértékben függ attól, hogy a fejlődés melyik stádiumából származik a donor sejt sejtmagja.

Azt is megfigyelték, hogy a 4 sejtes állapot metafázisában a sejtek klónozási hatékonysága sokkal nagyobb, mint a magzatból származó metafázisos fibroblaszt sejteknél. (43% a 4 sejtes állapotú sejteknél; 3% a magzati sejteknél).
A blasztomer sejtek előnye a többi sejttel szemben az, hogy totipotens, így epigenetikailag összeegyeztethető azokkal a sejtekkel, amelyek részt vesznek a korai embrió kialakításában.

Embrionális őssejtek:(ES)

Ezek a sejtek pluripotensek, amelyek nem képesek extraembrionális szövet kialakítására, de a csíralemezek és az ivarsejtek képzésére alkalmasak. Nagy hatékonysággal klónozhatók.

Ugyanúgy, mint a blasztomereknél, itt sincs szükség arra, hogy a sejt DNS-ét
újraprogramozzák. Az ES-nél legnagyobb gondot az jelenti, hogy epigenetikailag instabilak, így akár a DNS metilációs mintázat, valamint a genomikus imprinting is különbözhet a kiindulási sejttől, ami a genom instabilitását fokozhatja.

Primordiális csírasejtek (PGC)

Az emlősökben ezek a csírasejtek prekurzorai. A PGC-k epigenetikai mintázata drasztikusan különbözik minden más sejttípusétól. Ez elsősorban a metilációnal okoz gondot, és így genomikus imprinting zavar keletkezhet. Ha egy genom szintű demetiláció következik be, akkor egyes allélpárok specifikus metilációja törlődhet, így aktiválódhat az eredetileg inaktív X kromoszómán lévő allél is. A genomikus imprinting hiánya biallélikus expressziót vagy repressziót idézhet elő egyes géneknél. Ez a genotípus komoly fejlődési rendellenességeket vált ki. A PGC klónozási hatékonysága nagyon alacsony, a fentebb említett okok miatt.

Embrionális csíra sejtek

Az embrionális csírasejtekből alakulnak ki később a herék és a petefészkek. Ezek ugyanúgy pluripotensek, mint a ES-ek. Mivel az imprinting mintázatuk eltér az egyéb sejtekétől, így ezek is nehezen kezelhetők. Hasonlóan a PGC sejtekhez nehézkes az alkalmazásuk a klónozásban. Ráadásul az epigenetikai stabilitásuk hasonló az ES-hez. A DNS metilációs állapota sem stabil, attól is függhet, hogy mikor izolálják azokat.
Nem mindegy hogy, milyen sejttípust használunk fel donorként. Az embrionális sejtekkel sokkal könnyebb klónozni, mivel nem mindig szükséges újraprogramozni azokat. A fejlődés előrehaladtával egyre több módosítás megy végbe a sejtek genomjában, így annál nehezebb azokat újraprogramozni, a klónozás hatékonysága egyre kisebb lesz.

Szomatikus klónozás sejttípusai:

Felnőtt őssejtek:

A felnőtt szervezet is tartalmaz őssejteket. Ezek az őssejtek multipotensek, csak korlátozott differenciálódási képességgel rendelkeznek. Ezek a sejtek végzik a szervezetben egyes szöveti sejtek utánpótlását. Hátrányuk, hogy nehezen lehet izolálni és tisztítani ezeket, viszont klónozásra alkalmasak lehetnek. Korábban úgy gondolták, hogy minden szöveti őssejt csak az adott szövet sejttípusának előállítására képes. A mostani kísérletek azt bizonyítják, hogy a szöveti őssejtek plaszticitása nagy. Így lehetséges, hogy ezeket totipotenssé tegyék.

Progentior sejtek

Unipotensek, azaz csak egyféle sejttípust képesek kialakítani. A klónozási hatékonyságuk nagyobb, mint más szomatikus sejtté. A különbség fibroblasztokkal, vagy kumulusz sejtekkel szemben kb.:10%!

Terminálisan differenciálódott sejtek

Ezeket a sejteket is lehet totipotenssé átalakítani. Ezt bizonyították Dolly klónozásával.
Három különböző kísérletben eltérő sejttípusokat alkalmaztak. Az első kísérletnél ES.-t, a másodiknál fibroblasztot, a harmadiknál a juh emlőhámsejtjeit használták. Mindegyik sejttípusból külön-külön sejttenyészetet hoztak létre. A sejteket felszaporították, majd a klónozás hatékonyságának növelése céljából a fetal calf szérum csökkentésének a hatására a sejtek G0 állapotba kerültek. Egy-egy ilyen G0 fázisban lévő sejtet izoláltak és olyan petesejtbe ültették bele, amelyet már előzőleg megfosztottak a sejtmagjától és a sarki sejtjétől. Elektromos áram hatására sejtfúziót indukáltak és osztódni kezdett az embrió. Az ily módon létrehozott embriót egy hormonálisan stimulált álvemhes nőstény állat méhébe ültették.

Mindegyik sejttípus esetében sikerült normálisan fejlődő életképes utódokat kapni.
Dollynál a klónozás hatékonysága még csak 0,4 % volt, ez a hatékonyság manapság már 10 illetve 20%-ra nőtt. A klónozási hatékonyság növelésénél természetesen figyelembe kell venni, hogy a petesejt citoplazmája és a donor sejt magja szinkronban legyenek egymással. Így megnövelhető a reprogramozás hatékonysága. Ezért használtak Dollynál is G0 fázisú sejteket.

A szinkronizáció azért is fontos, hogy a sejtben ne legyen kromoszómaszám eltérés. Az MII fázisban lévő petesejtben a cyclinB és a M-CDK komplex aktivitása nagy. Az M-CDK felelős többek között: a mitotikus orsó működéséért, kromoszóma kondenzáció elindításáért, a kromoszómák orsóhoz kapcsolódásának biztosításáért, magmembrán felbomlásáért, a citoszkeleton átrendeződéséért, valamint a Golgi és ER átrendeződés biztosításáért. Az MCDK aktivitását stabilizálja a calcium szenzitív citosztatikus faktor (CSF). Az aktiváció után megnövekszik a calcium szint, ezzel inaktiválódik a CSF, és előidézi a cyclinB degradációját, majd az anafázist elősegítő komplex aktiválódik, ami inaktívvá teszi az M-CDK-t

Klónozás szempontjából az előbb leírt folyamat döntő fontosságú. Amikor a petesejtet megfosztjuk a magjától, MII fázisban van, ilyenkor magas az M-CDK aktivitás a citoplazmában. Ha ebbe a sejtbe egy olyan sejtmagot ültetünk be, ami az M fázisban volt,
akkor teljesen szinkronizáltuk a genetikai anyagot a citoplazmával, hiszen tovább folytatódik a mitózis a megfelelő komplexekkel. Ugyanakkor ha a donor sejt sejtmagja G0 fázisban van, egy olyan petesejtbe kell beültetni, ahol az M-CDK nem aktív, mert még nem ment át a sejt az S fázison és így a kromoszóma ploiditás nem lesz megfelelő.

Vajon a klónok tényleg azonosak genetikailag az donorral?

A nukleáris géntranszfer során nem teljesen azonosak genetikailag a klónok az anya állattal, hiszen a mitokondriális DNS a recipiens petesejttől származik. Ezért elvileg teljesen azonos génállománnyal csak nőstényeket lehetne klónozni, saját petesejtjük felhasználásával. Nőstény sejtdonor esetében az X kromoszóma inaktivációja is eltérhet az anyaállattól.

A telomerek problémája

Néhány tanulmány szerint a differenciálódott testi sejtekből klónozott egyedek telomerjei rövidek, így a klónozott állatok kevesebbet élnek, mint a természetes úton fogant állatok. Dolly valóban gyorsabban öregedett, mint a normál bárányok. Erre a korai öregedésre utalhatott az ízületi gyulladása is. A többi klónozásnál viszont nem voltak rövidebbek a telomerek a normálishoz képest. A telomeráz enzim, amely embrionális korban aktív, meghosszabítja az szomatikus sejtből származó rövid telomereket, így nem okoznak korábbi öregedést.

A klónozással lehetővé vált az, hogy egy szomatikus sejtet totipotenssé tegyünk. Ezt fel lehet használni terápiás célokra is.

A terápiás klónozás lépései

Első lépésben a testi sejt magját a magjától megfosztott petesejtbe juttatják (CNR, Cell Nuclear Replacement). Az így létrehozott sejt tenyésztése után létrejön a hólyagcsíra állapot. Ebből a hólyagcsírából embrionális őssejteket kapunk, majd ezeket az őssejteket is tenyésztjük.

Az őssejt-tenyészetet differenciáltatjuk a megfelelő irányba így a kívánt sejttípust létre lehet hozni. Végül az előállított sejteket visszajuttatjuk a betegbe.

Ezzel a technikával tulajdonképpen az ember a saját sejtjeit kapja vissza, a kilökődés veszélye nem áll fenn. A terápiás klónozásban Tabar V és mtsai nagy sikereket értek el. Fiatal egér farkából sejteket nyertek, és őssejtvonalat hoztak létre, minden egérhez legalább egy DNS-specifikus vonalat.

Az őssejtek indukció hatására a sejtek dopamin termelő idegsejtekké fejlődtek. Minden egérnek beadták a saját sejtjeiből származó differenciált őssejteket. A kezelt egerek viselkedésteszteken, immunológiai és motoros vizsgálatokon jobb eredményeket mutattak, mint a nem specifikus sejtekkel kezelt egerek. Immunológiai reakciót sem tapasztaltak. A klónozásnak azonban más hátránya is van. A klónozott embriók nagyobb méretűek mint a normál embriók, emiatt több a szülési nehézség valamint az elhullás.

A terápiás klónozás lehetősége, felvet néhány etikai problémát is. Emberi lénynek tekinthető-e a hólyagcsíra? Ha igen fel lehet-e használni egy mesterségesen létrehozott emberi lényt terápiás célra?

Hogyan fejlődik vissza a petesejt hatására a testi sejt őssejtté, mert amennyiben ezt sikerül kideríteni, nincs szükség többé petesejtekre?

A technika alkalmas arra is, hogy transzgenikus állatokat állítsanak elő. Schnieke AE és mtsai. Létrehoztak két transzgenikus birkát Polly-t és Molly-t. Tk az első transzgenikus birkák. Az állatokat fibroblaszt sejtekből klónozták. Tejükben véralvadási faktort választanak ki.
Véleményem szerint a nukleáris gén transzfer technológiája jelentős áttörést hozott, nemcsak a klónozás terén, hanem az őssejtkutatásokban is. Az emberiség egy olyan technológiához jutott, amellyel korlátlan mennyiségű személyre szabott őssejtet lehet előállítani. Angliában már engedélyezik az őssejtek terápiás alkalmazását. Természetesen sok még a megválaszolatlan kérdés, de remélem, hogy lehetővé válik több ma még halálos betegség gyógyítása ezzel a módszerrel.

Dr. Dinnyés András előadása alapján készítette Páhi Zoltán Gábor